Análisis Molecular (PCR por aislamiento isotérmico) y Análisis en Fresco para Detectar la Bacteria Hepatobacter penaei (NHP) en Dos Fincas Camaroneras del Estado Falcón, Venezuela

La Hepatopancreatitis Necrotizante (NHP) es una enfermedad bacteriana causada por Hepatobacter penaei, una rickettsia gram-negativa intracelular que infecta el citoplasma de las células epiteliales de los túbulos del hepatopáncreas. Forma granulomas y puede generar mortalidades de entre 20 % y 95 % en fincas de Litopenaeus vannamei, según la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE).

Para reducir brotes, las fincas establecen programas de muestreo con apoyo de laboratorios de patología. El análisis en fresco se aplica ampliamente por su bajo costo y mínimo equipamiento, pero presenta limitaciones de sensibilidad. La PCR por aislamiento isotérmico (iiPCR) —técnica similar a LAMP que opera a temperatura constante— ofrece alta especificidad y rapidez (≈1 hora), permitiendo lectura en campo con equipos portátiles.

El objetivo de esta investigación fue correlacionar ambas técnicas (análisis en fresco vs. iiPCR) para detectar H. penaei en dos fincas del estado Falcón donde se produjo un brote de NHP en 2021.

El estudio se realizó en la costa occidental del estado Falcón (Golfo de Venezuela), municipio Mauroa. Finca 1 (F1): 50 estanques operativos, próxima a San Félix (10°58′19″N 71°14′38″W). Finca 2 (F2): 60 estanques operativos, próxima a Casigua (11°04′36″N 71°01′52″W).

El muestreo se realizó con atarraya de 2 m, capturando 10 individuos por estanque para el análisis en fresco. Bajo microscopía óptica (10x y 40x) se observó deformación, atrofia y constricción de los túbulos hepatopancreáticos con desprendimiento e hipertrofia celular.

Para el análisis molecular se utilizó el equipo POCKIT™ y el kit NHPB IQ Plus: se digirió hepatopáncreas (10–25 %) con soluciones 1 y 2, se centrifugó, se transfirió a tubos columna y se obtuvo el extracto de ADN con la solución 3. Se añadió premix buffer (50 µL) a los tubos premix específicos para H. penaei, se inoculó el extracto de ADN, se transfirió a tubo R, se centrifugó 10 s y se procesó a 520 nm + 550 nm.

Finca 1: Se detectó deformación de túbulos hepatopancreáticos únicamente en el estanque 17, con una Frecuencia Relativa de pozos enfermos de FR=0,02 y FR de pozos sanos de 0,98. Solo el 2 % de los estanques muestreados presentó las características clínicas de la enfermedad.

Finca 2: Se detectó NHP en los estanques 1, 30 y 31, con FR=0,05 de pozos enfermos y 0,95 de pozos sanos. El análisis en fresco indicó una enfermedad poco común, aunque con mayor presencia que en F1.

Finca 1: La PCR isotérmica reveló pozos positivos con FR=0,06 (estanques 17, 18 y 34), confirmando los hallazgos del fresco pero detectando casos adicionales no visibles bajo microscopía.

Finca 2: La iiPCR detectó FR=0,25 de pozos enfermos (15 estanques positivos: 1, 8, 24, 30, 31, 34, 36, 37, 39, 42, 43, 46, 53, 54, 55), evidenciando un número considerablemente mayor de falsos negativos del análisis en fresco. La técnica molecular mostró mayor sensibilidad y especificidad gracias a la amplificación específica de ocho regiones diana del genoma de H. penaei.

En F1, el Coeficiente de Correlación R=0,5654 indica una dependencia moderada entre el análisis en fresco y la PCR. El Coeficiente de Determinación R²=0,3197 señala que ambas técnicas se relacionan en un 31,97 %, con el 68,03 % restante negativo para NHP en ambos métodos.

En F2, R=0,3973 indica poca dependencia entre variables y R²=0,1578 una relación de apenas 15,78 %. La diferencia entre las fincas podría deberse a la calidad fisicoquímica y microbiológica del agua: trabajos previos del grupo (Pascal et al., 2022) reportaron mayor prevalencia de enfermedades parasitarias en la misma zona geográfica donde se ubica F2.

Los resultados demuestran que la iiPCR ofrece mayor sensibilidad y precisión que el análisis en fresco para detectar H. penaei. En medicina, un falso negativo es un error donde el análisis no detecta una patología existente; en F2 esto fue evidente, ya que la mayoría de los pozos negativos al fresco resultaron positivos por PCR.

Vincent y Lotz (2005) ya establecieron la histopatología y la PCR en tiempo real como métodos de mayor precisión para detectar de manera temprana la infección por H. penaei. Nuestros hallazgos respaldan esa conclusión y muestran que el análisis en fresco, si bien útil como tamizaje rápido y económico, debe complementarse con técnicas moleculares para evitar diagnósticos tardíos.

La iiPCR aporta gran versatilidad y poder analítico: sus reactivos, ADN polimerasa y diseño de primers para ocho regiones diana del genoma de H. penaei permiten amplificación específica y lectura rápida, incluso en condiciones de campo.

En F1, la Frecuencia Relativa de NHP fue menor que en F2, donde se reportaron más casos de la enfermedad. La PCR por aislamiento isotérmico demostró ser una herramienta de mayor sensibilidad y precisión que el análisis en fresco, especialmente en F2 donde aumentaron considerablemente los falsos negativos.

Se recomienda integrar el análisis molecular en los programas sanitarios de las fincas camaroneras como complemento al análisis en fresco, para una detección temprana y precisa de NHP que mitigue las pérdidas económicas en el sector.